在掃描電子顯微鏡 (SEM) 中，對(duì)某些敏感樣品進(jìn)行冷凍處理可以顯著減少電子束損傷，特別是對(duì)一些生物樣品、聚合物或其他低導(dǎo)電性材料。冷凍 SEM 技術(shù)（Cryo-SEM）通過(guò)將樣品快速冷凍并維持低溫環(huán)境來(lái)避免電子束引起的樣品變形或損壞。以下是如何在 SEM 中進(jìn)行樣品冷凍以減少電子束損傷的步驟和方法。

1. Cryo-SEM 的原理

Cryo-SEM（冷凍掃描電鏡）通過(guò)快速冷凍樣品并維持在低溫度下成像，避免了電子束在樣品上產(chǎn)生的熱效應(yīng)和化學(xué)變化。這種方法的主要目的是：

防止水分蒸發(fā)，特別是對(duì)含水的生物樣品或水凝膠類材料。

通過(guò)降低溫度來(lái)減少電子束引起的損傷、熱效應(yīng)和樣品帶電效應(yīng)。

保持樣品的自然狀態(tài)而不需要進(jìn)行復(fù)雜的化學(xué)固定或鍍膜。

2. 樣品制備步驟

冷凍 SEM 樣品的制備是 Cryo-SEM 成像中關(guān)鍵的部分。以下是典型的樣品制備流程：

1) 快速冷凍（快速凍結(jié)）

樣品需要通過(guò)快速冷凍（通常稱為 vitrification）來(lái)保持樣品原始狀態(tài)，避免冰晶的形成。

常用的方法包括浸入冷凍或高壓冷凍。浸入冷凍：將樣品快速浸入液氮或液氮溫度的液體（如液態(tài)丙烷）。這一過(guò)程可使水分以玻璃態(tài)（非晶態(tài)）凍結(jié)，避免晶體冰的形成。

高壓冷凍：使用高壓冷凍裝置對(duì)樣品施加高壓，迅速降低溫度以抑制冰晶生成。

2) 轉(zhuǎn)移到冷凍樣品臺(tái)

冷凍后的樣品需要在低溫環(huán)境下轉(zhuǎn)移到 SEM 的冷凍樣品臺(tái)上。這通常是通過(guò)冷凍轉(zhuǎn)移桿進(jìn)行的，確保樣品不與環(huán)境接觸，避免升溫。

樣品的溫度通常保持在 -140°C 到 -196°C，具體取決于樣品的特性和成像要求。

3) 樣品鍍膜

雖然低溫可以減少樣品損傷，但仍然有些樣品（如絕緣材料或生物樣品）在電子束下可能產(chǎn)生帶電效應(yīng)。這時(shí)可以使用低溫鍍膜技術(shù)（通常為金、鉑或碳），在樣品表面沉積一層導(dǎo)電薄膜來(lái)減少帶電效應(yīng)。

鍍膜過(guò)程也須在低溫下進(jìn)行，以保持樣品的冷凍狀態(tài)。

3. SEM 冷凍系統(tǒng)操作

冷凍樣品準(zhǔn)備好后，需要將其插入到 SEM 中的冷凍系統(tǒng)?，F(xiàn)代 Cryo-SEM 通常配備了冷凍臺(tái)和低溫裝置，可以穩(wěn)定保持樣品的冷凍狀態(tài)。

1) 加載樣品

使用冷凍轉(zhuǎn)移桿將樣品從冷凍準(zhǔn)備臺(tái)轉(zhuǎn)移到 SEM 的冷凍樣品室。

樣品被安裝在冷凍樣品臺(tái)上，并通過(guò)液氮冷卻系統(tǒng)保持低溫。

2) 調(diào)節(jié)溫度

通過(guò) SEM 的軟件接口，可以設(shè)定并監(jiān)控樣品臺(tái)的溫度。通常控制在 -150°C 到 -190°C，具體取決于樣品的特性。

樣品在整個(gè)成像過(guò)程中需要保持在設(shè)定溫度，以避免由于溫度波動(dòng)而導(dǎo)致樣品變形或損壞。

4. 電子束設(shè)置與操作

在 Cryo-SEM 中，電子束的參數(shù)設(shè)置也應(yīng)根據(jù)樣品的低溫特性進(jìn)行調(diào)整，以進(jìn)一步減少電子束損傷：

降低加速電壓：低導(dǎo)電性樣品容易受到電子束損傷，因此需要使用較低的加速電壓（例如 1 kV 到 5 kV），減少對(duì)樣品的損傷。

降低束流密度：減少電子束的強(qiáng)度和束流密度也能降低熱效應(yīng)和損傷。

控制掃描速度：通過(guò)使用較慢的掃描速度，能夠進(jìn)一步減小熱累積，并有助于減少對(duì)樣品的損壞。

5. 低溫成像技術(shù)

在低溫環(huán)境下進(jìn)行成像可以大幅減少樣品的損傷，特別是在生物學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域。以下是兩種常見(jiàn)的成像方式：

1) 冷凍斷裂法（Cryo-fracture）

對(duì)于細(xì)胞或其他多層樣品，冷凍斷裂技術(shù)能夠在低溫度下將樣品斷裂，暴露內(nèi)部結(jié)構(gòu)。隨后可直接在 SEM 中成像，以觀測(cè)次表面結(jié)構(gòu)。

樣品斷裂后，仍需保持在冷凍臺(tái)上，并進(jìn)行成像操作。

2) 冷凍蝕刻（Cryo-etching）

在某些情況下，樣品表面被冷凍覆蓋的物質(zhì)（如水分）會(huì)影響成像。冷凍蝕刻可以通過(guò)逐步升溫，讓樣品表面升溫到略高于冷凍溫度（如 -90°C 到 -100°C），以輕微升華表面水分，暴露出樣品的表面結(jié)構(gòu)。

該過(guò)程使樣品表面更加清晰，有利于高分辨率成像。

6. 成像后處理與升溫

在成像結(jié)束后，樣品通常需要經(jīng)過(guò)升溫和解凍處理：

升溫控制：逐步升溫可以避免樣品因快速升溫而破壞結(jié)構(gòu)，特別是在需要進(jìn)一步處理或分析的情況下。

樣品處理：根據(jù)樣品性質(zhì)，可以在升溫后對(duì)其進(jìn)行其他表面處理、化學(xué)分析或保存。

以上就是澤攸科技小編分享的如何在掃描電鏡中進(jìn)行樣品冷凍以減少電子束損傷。更多掃描電鏡產(chǎn)品及價(jià)格請(qǐng)咨詢15756003283(微信同號(hào))。